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蛋白質磷酸化Western Blot修飾研究的新方法

Introduction

蛋白質磷酸化對于許多生物現象的引發是很必要的，包括細胞生長、增殖、泛素（ubiquitin）介導的蛋白降解等過程。特別是酪氨酸磷酸化，作為細胞信號轉導和酶活性調控的一種主要方式，通常通過引發蛋白質之間的相互作用，進而介導生長因子、荷爾蒙和細胞因子等對細胞膜上受體的信號調控。

然而，酪氨酸磷酸化在細胞的所有磷酸化修飾中所占的比例卻非常低。大概10%的細胞蛋白會受到磷酸化共價修飾，但每100次蛋白的磷酸化修飾中僅有1次酪氨酸基團的修飾。與大部分細胞中的絲氨酸和蘇氨酸磷酸化水平相比，酪氨酸磷酸化的水平估計要低2000倍。正是由于細胞中酪氨酸磷酸化的水平相當低，才能保證細胞在內外信號的刺激下，作出靈敏的反應，所以研究酪氨酸的磷酸化對于細胞信號的調控和許多重要生物現象的研究具有極為重要的意義，而對發生酪氨酸磷酸化的蛋白質的識別及磷酸化位點的鑒定對揭示細胞過程的調控和藥物的作用位點起到非常重要的作用。研究蛋白質磷酸化的相關方法：

磷酸化Western Blot：

對于信號轉導科研來說，抗酪氨酸磷酸化抗體的出現是一個意義重大的事件。在沒有抗酪氨酸磷酸化抗體之前，蛋白質和酶的酪氨酸磷酸化只能通過非常危險的并且很費時的放射性實驗來檢測。而利用抗酪氨酸磷酸化抗體，則可以通過Western Blot或其它免疫學方法輕松地檢測到磷酸化信號。常規的檢測方法包括：用抗酪氨酸磷酸化抗體在Western Blot上檢測內源或外源表達的磷酸化蛋白。如果目標蛋白的含量較低，也可利用免疫沉淀的方法先富集發生磷酸化的酪氨酸蛋白，再檢測目標蛋白的水平。抗酪氨酸磷酸化抗體也常用于檢測在不同處理的條件下，細胞內總的酪氨酸磷酸化水平的變化情況，作為許多細胞生物現象的一個重要指標。

我們都知道如果需要檢測某一個目標蛋白的某一特定位點的磷酸化狀態，可以選用該蛋白特定位點的磷酸化特異性抗體。但由于我們研究的通常是新的磷酸化位點，或者這些蛋白特定位點的磷酸化抗體效果不夠好，我們不得不自己制備磷酸化抗體。如果大家自己制備過磷酸化抗體，就會知道磷酸化抗體的制備比一般抗體的制備更加困難，而且浪費大量寶貴時間。現在國外的科學家發現可以使用通用型的磷酸化抗體，只要巧妙的設計實驗，也可以達到同樣的檢測目的。以Yuan的文章為例，他們需要檢測BCR-ABL的磷酸化，但他們沒有特異性的磷酸化抗體。他們首先使用了抗c-ABL的抗體和蛋白G-瓊脂糖珠子來免疫沉淀富集BCR-ABL蛋白，然后再通過Western-Blot和4G10通用型酪氨酸磷酸化抗體（pan-phosphotyrosine）來鑒定BCR-ABL蛋白的酪氨酸磷酸化水平。另外一組以Clemens為首的科學家，則利用抗Dock蛋白抗體先免疫共沉淀了DACK蛋白，再用4G10酪氨酸磷酸化抗體來檢測DACK蛋白和DSH3PX1蛋白的酪氨酸磷酸化水平，通過區分這些蛋白的分子量大小，來確認相應的磷酸化條帶的蛋白身份。

與做普通的Western Blot相比，磷酸化Western Blot有一些要額外需要注意的事項：

首先，由于蛋白的磷酸化是可逆的，會被磷酸酶去磷酸化，所以在樣品制備和整個免疫檢測過程中，需要抑制或避免細胞內源性和外源性的磷酸酶的干擾。針對細胞內源性的磷酸酶，我們在樣品制備時，需要在細胞裂解液中加入足量的并且是新鮮的磷酸酶抑制劑，如PhosphoSafe 系列。外源性的磷酸酶主要是由實驗過程中的其它試劑帶入的，比如我們要確保封閉劑中不含磷酸酶等。同時，樣品中或其它試劑中帶的細菌也會分泌外源性的磷酸酶，所以做磷酸化Western Blot的另一個關鍵是要盡量使用清潔的新鮮的溶液和新做的SDS聚丙烯酰胺凝膠，并且最好在樣品制備完就立刻上樣，當天完成SDS-PAGE和Western Blot 檢測。如果要使用同一塊Blot進行全蛋白的免疫檢測，就需要先做磷酸化的檢測再做全蛋白的檢測，以盡量避免磷酸化信號的丟失，這點非常重要。

有一些實驗是用Western Blot來驗證一組磷酸化的多肽或蛋白的存在，這時候就需要使用的通用型磷酸化抗體。因為通用型磷酸化抗體，如4G10酪氨酸磷酸化抗體，具有廣泛的識別范圍，同時具有很好的磷酸化特異性，才不會導致假陰性結果的產生。

以Liu的研究為例，他們就使用了通用型的抗酪氨酸磷酸化抗體4G10和PY20，利用Western Blot技術來驗證其通過多肽芯片篩選出的多肽結果。他們的實驗室是這樣設計的，首先利用磷酸化酪氨酸的多肽芯片（phospho-tyrosine peptide array）來篩選與SH2結構域結合的磷酸化多肽序列，然后對這些合成的多肽序列進行Western Blot驗證，利用通用型的抗酪氨酸磷酸化抗體4G10和PY20檢測其磷酸化水平。他們發現不同的抗體具有很不一樣的識別特異性，如pTyr-Pro 序列能被某些SH2結構域結合，而不被4G10和PY20識別。但就總體而言，通用型的抗酪氨酸磷酸化抗體可以識別絕大多數的SH2結構域結合的磷酸化多肽，特別是4G10抗體比PY20抗體能識別更多的磷酸化酪氨酸多肽。

磷酸化蛋白質組學（PhosphoProteomics）：
磷酸化蛋白質組學與蛋白質組學類似，可以通過2D膠和質譜MS鑒定出新的磷酸化蛋白和蛋白的新磷酸化位點。但是利用MS從磷酸化蛋白中檢測出磷酸化肽段會遇到許多問題，這是由于樣品中大量的非磷酸化肽段的存在使磷酸化肽段的相對濃度降低造成的。大量的非磷酸化肽段會抑制MS對磷酸化肽段的檢測，因此必須采取額外的實驗步驟在MS之前富集磷酸化蛋白或磷酸化肽段。對此，抗磷酸化特異性抗體以及親和層析瓊脂糖珠子或柱子就能起到很好得到富集作用。特別是對于細胞中比例很低的酪氨酸磷酸化的研究來說，富集的過程尤顯重要。目前，通用型的抗酪氨酸磷酸化（pan-phosphotyrosine）單克隆抗體4G10和PY20已被證明對尋找蛋白酪氨酸磷酸化位點起到很好的作用。除此以外，也有一些通用型的抗絲氨酸和蘇氨酸磷酸化的抗體如4A4，也可用于MS之前富集絲氨酸和蘇氨酸磷酸化的蛋白。

Guha研究組就是利用這種方法來研究EGFR和KRAS的磷酸化水平變化的。

在肺腺癌（lung adenocarcinoma）病人中，原癌基因EGFR和KRAS是兩個最經常發生突變的基因。但是帶有EGFR不同的突變或帶有KRAS的突變的病人，對TKI治療法（酪氨酸激酶抑制劑治療法）有不同的治療效果。Guha等人通過磷酸化蛋白質組學的方法來比較帶這些不同突變的病人的磷酸化蛋白的情況，揭示這些突變的細胞內EGFR和KRAS的下游信號通路的變化，從而揭示了解造成TKI治療不敏感的機理。

首先，Guha等人使用了偶聯了抗酪氨酸磷酸化抗體的瓊脂糖珠子（4G10-agarose），對帶有不同突變的細胞裂解液進行免疫沉淀。通過這一步，可以對發生酪氨酸磷酸化的蛋白以及與這些磷酸化蛋白緊密結合的其它蛋白進行有效的富集。免疫沉淀的蛋白可以被100mM的磷酸苯酯洗脫出來，然后進行透析，為下一步跑膠做去除過多的鹽分和離子的準備。其實，透析很費時間，而且蛋白樣品甚至會被稀釋，可以選擇使用超濾離心（Amicon Ultra）的方法用半小時就可去除離子同時濃縮樣品。接下來，處理好的磷酸化蛋白樣品通過SDS-PAGE 膠分開后，進行質譜分析前的常規處理，包括使用Coomassie 染料進行染色，把膠切成20-30塊小塊，胰酶消化成多肽片段等。通過LC-MS\MS，即可定性和定量的分析發生酪氨酸磷酸化的蛋白以及與這些磷酸化蛋白緊密結合的其它蛋白。已被鑒別出的這些蛋白，可以用Western blot的方法，并結合使用特異性蛋白抗體和4G10抗體，對這些蛋白的酪氨酸磷酸化狀態進行進一步確認。

Lind等人的研究也利用了類似的方法，在做質譜分析之前，使用通用型的抗酪氨酸磷酸化抗體來富集磷酸化蛋白或肽段。有趣的是，他們與前面提到的Liu的文章有一致的發現，在文中使用的5種酪氨酸磷酸化抗體中，使用4G10抗體富集的MS結果最后識別了最多的潛在酪氨酸磷酸化蛋白。

除了這種磷酸化蛋白質組學的通用方法以外，現在也出現了創新的方法來幫助研究磷酸化蛋白質組學。其中基于Luminex xMAP和Epitome的Epiquant技術，就實現了對多種蛋白的磷酸化和同一蛋白上的多個磷酸化位點以及全蛋白，同時進行高通量地定量檢測。考慮到同時檢測同一個細胞上，同一條Pathway上、下游蛋白的協同作用，可使用流式細胞術進行研究。

蛋白酪氨酸激酶（PTK）活性分析：

酪氨酸磷酸化由蛋白酪氨酸激酶（PTK）誘導。PTK有很多的種類，包括跨膜的和細胞質內可溶性的酶。PTK在多種細胞過程中發揮了極其重要的作用，其中包括細胞生長、分化和新陳代謝等。許多疾病也與某些PTK失調密切相關，比如造血系統的惡性腫瘤、腎細胞癌、甲狀腺癌等多種癌癥以及糖尿病、類風濕性關節炎等等。因此，對于PTK的活性分析也是細胞調控研究和藥物研發中常常需要進行的研究。通過PTK的活性分析可以篩選PTK抑制劑，并可以獲得這些抑制劑的IC50參數。

PTK的活性分析最傳統的方法就是使用同位素的PTK的活性分析，后來也有多種非放射性的較安全的分析方法，例如，有基于ELISA的PTK活性分析，其中應用了可以被許多PTK磷酸化的隨機多肽序列和HRP偶聯的抗酪氨酸磷酸化的特異性抗體。也有基于競爭性結合的熒光偏振的分析方法。現在，更有基于HTRF (homogenous time-resolved fluorescence) 的全新的PTK活性分析方法。這種方法利用了熒光共振能量轉移（FRET）的原理，比基于ELISA和基于熒光偏振的方法更靈敏，信號也更穩定，對于需要一段時間孵育的激酶分析來說會更有優勢。以通用型的4G10 HTRF分析為例，它使用了偶聯于Europium的工業化標準單克隆抗體4G10，生物素標記的酪氨酸多肽底物，和APC標記的鏈霉素等。只要在體系中加入PTK激酶后，若多肽底物發生磷酸化，則此底物能被4G10抗體結合，導致熒光染料APC和Europium的距離很近足以發生熒光共振能量轉移，激酶的活性越強則HTRF信號的加強越顯著（實驗原理見下圖）